在现代生命科学中，蛋白质的一级结构，即其氨基酸序列，早已不再被视为静态的分子代码。蛋白质序列不仅决定其空间构象和功能特性，更深刻影响细胞行为、信号通路动态，甚至与进化路径和疾病机制相关。因此，获取蛋白质的准确序列成为深入理解其生物学功能及作用机制的起点。

与传统的“蛋白鉴定”中的“归类识别”不同，蛋白测序（Protein Sequencing）专注于完整而连续的氨基酸信息，以解决诸如解析未知蛋白、识别序列突变、确认药物蛋白一致性或者追踪翻译后修饰等关键科研任务。在生物药开发、个体化医学、结构生物学、抗体工程等高精度领域，蛋白测序技术的精细化能力逐渐成为研究与应用决策的重要技术杠杆。

一、蛋白测序与蛋白鉴定的区别

在蛋白质组学研究中，“测序”和“鉴定”常常被交替使用，这可能导致术语误用、技术选择失误，甚至研究假设模糊。从定义上讲，蛋白测序是对蛋白质进行氨基酸序列解析的过程，旨在重建其一级结构的连续排列。其目标是获取“序列本体”，而非仅判断蛋白的“存在性”或“类别归属”。

蛋白鉴定（Protein Identification）则依赖质谱-数据库匹配，确定某一肽段是否“属于”某已知蛋白。这是一种分类上的“归属判断”，而非逐位点的信息重建。

二、蛋白测序技术的演化

1. Edman降解：高精度线性识别的开端

Edman降解由Pehr Edman于20世纪50年代建立，是蛋白质序列解析的首次化学实现。该方法基于苯异硫氰酸（PITC）对N端氨基酸的特异性反应，通过顺序标记与切除，依次释放并鉴定每一个氨基酸，从而实现线性序列重建。虽然Edman法在单个氨基酸级别的识别精度极高，但其应用范围受到游离N端、序列长度和混合物处理能力等限制。

2. Bottom-up质谱策略：高通量测序的核心

质谱技术的引入标志着蛋白测序发展的一次重要转折。Bottom-up策略通过特异性蛋白酶将蛋白质酶解为短肽段，再通过质谱分析重建蛋白质序列。该策略因其良好的通量、覆盖度与适配性而成为广泛应用的蛋白测序方法。然而，它的测序能力也面临上下文信息缺失、修饰定位依赖碎片完整性等结构性限制。

3. Top-down质谱策略：整分子结构识别的深入拓展

Top-down测序策略省略了酶解步骤，直接将完整蛋白质送入高分辨率质谱系统，通过高能碎裂解析其多级碎片离子。这一方法能够在不破坏蛋白天然修饰的前提下，提供精确的序列与修饰定位信息，尤其适用于蛋白质翻译后修饰识别及生物药质量属性评估。

4. 单分子蛋白测序的兴起

传统质谱测序策略依赖肽段碎裂和谱图反演。新的单分子蛋白测序（SMPS）技术则不需酶解或拼接，可以直接读取氨基酸序列。这种方法的核心理念是，在不破坏蛋白整体结构的条件下，实现对单个分子的逐残基识别。

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