在细胞培养的过程中，正确的培养条件与操作步骤至关重要。此处介绍适用于贴壁细胞和悬浮细胞的培养方法，以确保细胞能够健康生长与繁殖。

培养条件

气相组成：95%空气与5%二氧化碳；适宜温度为37℃，使用的培养基为MEM，添加10% fetal bovine serum (FBS) 和1% penicillin-streptomycin (P/S)。

细胞传代方法

细胞传代的建议是在细胞汇合度超过80%时进行，如汇合度未达80%，则需将瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基，放入37℃、5% CO2的孵箱进行培养。

贴壁细胞传代步骤

1. 弃去培养上清后，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 在培养瓶中添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状态，若大多数细胞变圆并脱落，迅速加5ml以上完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落，吸出后转移至15ml离心管，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基并重悬。
4. 按1:2的比例将细胞悬液分瓶传代，补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

悬浮细胞传代步骤

1. 使用半换液法处理，竖着放置培养瓶静置1小时，轻轻吸掉3ml培养基，并补全3ml的完全培养基。如果培养基颜色变化缓慢，可以直接添加500ul左右的FBS。
2. 如需分瓶，将细胞悬液收集至离心管中1000rpm离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml培养基后重悬混匀，按1:2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml新的完全培养基以维持细胞活力。

细胞冻存

细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去培养液，用PBS清洗一次；然后加入0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察至细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养基终止消化，轻轻吹打使细胞脱落。将悬液转移至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清，加入1ml无血清冻存液（生物品牌货号：C7001），混匀后放入冻存管中。

细胞复苏

从液氮中取出细胞冻存管，快速置入37℃水浴中解冻，待无晶体后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。将细胞转移至含5ml完全培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清，重悬用5ml完全培养基并接种至T25培养瓶，在37℃、5% CO2培养箱中继续培养。

注意事项

在细胞培养的过程中，若发现细胞贴壁不牢，在运输过程中可能会发生脱落。这是正常现象。若脱落的细胞比例较高，可以将培养瓶中的所有培养液收集至离心管中进行后续操作。

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