### 培养条件

气相条件：95%空气 + 5%二氧化碳；培养温度：37℃。使用的培养基为DMEM，配以10% FBS和1% P/S。A-673细胞株源自15岁女性的横纹肌肉瘤，能够在软琼脂上形成克隆，并可在免疫抑制小鼠中形成肿瘤。该细胞株具有四个以上的标志性染色体，伴有一个额外的F染色体和两个异常的B染色体。首次传代建议采用1:2的比例。

### 细胞处理与培养

在接收细胞后，建议采用以下步骤进行处理：首先用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后在超净台内进行无菌操作。细胞应在37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时以稳定状态，并在显微镜下观察其生长情况。对不同放大倍数的细胞进行拍照保存，前三天的照片为重要的售后依据，如未提供照片则默认细胞质量良好。

### 细胞传代步骤

若细胞未超过80%汇合度，将管内的完全培养液收集至离心管，保留5ml，并置于37℃、5% CO2培养箱中；如果细胞密度超过80%，则应进行传代。贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 加入约1-2ml 0.25%胰蛋白酶消化液，放置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞变化，若细胞大部分变圆脱落，轻轻敲打培养瓶，添加5ml以上完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使之完全脱落后吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，再补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后置入37℃、5% CO2培养箱中培养。

### 悬浮细胞的传代

悬浮细胞的传代步骤如下：

1. 采用半换液法，将培养瓶竖直放置1小时，再轻吸掉约3ml培养基，补给3ml的完全培养基。若培养基变色缓慢，可直接添加约500μl的FBS。
2. 如需分瓶，将细胞悬液收集至离心管中，1000 RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液重悬，按1:2的比例分到新的T25瓶中，并添加6-8ml新鲜完全培养基。

### 细胞冻存

细胞冻存步骤如下：

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%时，弃去培养液并用PBS洗涤一次。
2. 添加约1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻观察，在细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化，转移悬液至15ml离心管，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。
4. 将冻存管直接放入-80℃冰箱，继续存放24小时以上后可转入液氮罐中。

### 细胞复苏

细胞复苏步骤如下：

1. 从液氮中取出冻存管（佩戴防护面具），置入37℃水浴中解冻，检查无结晶后，用75%酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清后，用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，并放入37℃、5% CO2培养箱中。
4. 第二天更换新鲜完全培养基继续培养。

### 注意事项

注意某些细胞在运输过程中可能会脱落，这是正常现象。如发现脱落较多，可以将所有培养液收集至离心管，进行离心处理，重悬后进行细胞传代。务必确保操作过程的无菌，保证细胞的生长和活力。

在细胞培养领域，我们一直追求卓越，生活如同一场博弈，选择人生就是博-尊龙凯时，让每一步都充满可能性和挑战。